Modul 5 · Kapitola 1
Přímý dopad změny klimatu na hospodářskou výrobu: tepelný stres, příjem krmiv, produkce, rozmnožování, zdraví a úmrtnost
Produkty a služby související s chovem dobytka jsou pro lidi klíčové. Přibližně jednu čtvrtinu světové půdy, která není pokryta ledem, zabírá dobytek a jedna třetina veškeré orné půdy se využívá k pěstování plodin pro krmení zvířat [1]. Jedna třetina světové populace se spoléhá na chov zvířat jako na zdroj příjmů a přispívá asi 40 % celosvětového zemědělského HDP [2]. Globálně tvoří živočišné produkty jednu třetinu bílkovin, jednu pětinu kalorií a významnou část B12, železa a vápníku, které lidé konzumují. Poptávka po živočišných produktech roste spolu s růstem světové populace. Ale jak se globální klima mění, chov hospodářských zvířat pociťuje důsledky stále více. Mezi tyto důsledky patří rostoucí teploty, rozmanitější srážky, nárůst výskytu extrémních jevů a rostoucí hladiny oxidu uhličitého [3].
Kummu a kol. [4] předpovídají, že jedna třetina světové produkce plodin a více než 30 % živočišné produkce může být do roku 2081–2100 vytlačeno mimo stabilní klimatické podmínky, pokud se oteplení neomezí na 1,5–2 °C. V zásadě existují přímé a nepřímé dopady změny klimatu [5]. Změna klimatu a účinky CO2 na metabolismus hospodářských zvířat, imunitní funkce a regulaci teploty jsou označovány jako přímé dopady. Nepřímé dopady vyplývají z dopadů klimatu na krmivo pro hospodářská zvířata, dostupnost vody a společenství škůdců/patogenů.

Tepelný stres
Produkční výkonnost zvířat do značné míry závisí na podmínkách prostředí, ve kterých jsou chována. Optimální poměr teploty, vlhkosti a proudění vzduchu se nazývá zóna tepelné pohody a je druhově specifický. V této zóně je zvíře schopno dosáhnout optimální produkční výkonnosti s minimálními energetickými výdaji [5]. Když teplota stoupne nad tento rozsah, dochází k tepelnému stresu a organismus zvířete vynakládá další energii na regulaci tělesné teploty, což negativně ovlivňuje produktivitu. Pokud zvíře poskytuje odpovídající fenotypovou reakci na účinek tepelného stresoru, říkáme, že se adaptovalo, tedy aklimatizovalo [3]. Tepelný stres způsobený vysokou teplotou je větší problém a má větší vliv než stres způsobený nízkou teplotou [6]. Na pozadí klimatických změn znamená globální nárůst teploty, že větší význam je přikládán tepelnému stresu způsobenému účinky vysokých teplot. Tepelný stres je proto obecně považován za dominantní téma z hlediska tepelného namáhání.
Když zvířata nejsou schopna vydávat dostatek tepla k udržení homeotermie , vzniká tepelný stres [7]. Po „přehřátí“ dochází ke zrychlenému dýchání a tachykardii spolu se zvýšením tělesné teploty. V důsledku toho může dojít ke změnám v úmrtnosti a fungování imunitního systému, stejně jako ke snížení příjmu potravy, produkce mléka a reprodukční účinnosti. Souhrn různých fyziologických a biochemických změn spojených s tepelným stresem, ke kterým dochází na různých systémových úrovních v těle dojnic, je uveden na obrázku 2.
Při zvažování problematiky změny klimatu je důležité zdůraznit přizpůsobivost zvířat. Důležitou roli hrají kompenzační a adaptační mechanismy, které se aktivují při tepelné zátěži. Přestože jejich iniciace může vést ke snížení produktivity zvířat, dosažení homeotermie a homeostázy jako podmínek pro přežití je primárním cílem. Během tepelného stresu hraje humorální systém klíčovou roli v regulaci homeostázy prostřednictvím osy hypotalamus-hypofýza-nadledviny. Hlavním výsledkem této interakce je snížení hladiny růstového hormonu a tyroxinu, což snižuje aktivitu bazálního metabolismu. Vzhledem k dopadům klimatických změn existují způsoby, jak se jim bránit na buněčné úrovni, tedy geny. Na základě tzv. proteinů tepelného šoku, které hrají zásadní roli při adaptaci na tepelný stres, byly také identifikovány odpovídající geny odpovědné za aklimatizaci na buněčné úrovni. V genomu živočichů žijících v teplejším klimatu jsou častější takové geny, které lze v budoucnu pomocí pokročilých biotechnologických metod využít k úpravě genotypu s ohledem na adaptaci na změnu klimatu [8].

Příjem krmiva
Jednou z reakcí na horké prostředí je snížený příjem potravy. Zvýšený tepelný stres u přežvýkavců byl spojen se snížením hladu, rychlosti trávení a přežvýkavosti [9]. S nárůstem okolní teploty nad 25–26 °C a zejména nad 30 °C příjem krmiva u dojnic klesá [10].
Ve srovnání s jinými přežvýkavci jsou kozy méně náchylné k tepelnému stresu. Když je však venkovní teplota vyšší o více než 10 ° C nad jejich zónou tepelné pohody, jejich dobrovolný příjem potravy klesá [11]. Při zvýšení teploty z 20 na 35 °C mají prasata vystavená tepelnému stresu vyšší tělesné teploty a jejich příjem krmiva klesá asi o 11 % [12]. Tyto účinky přetrvávají i po ukončení vystavení zvířat tepelnému stresu. Proto bylo navrženo, že časné ranní krmení může pomoci zabránit sníženému příjmu potravy [13].
Bylo také zjištěno, že drůbež má snížený příjem krmiva při vysokých teplotách. Zvýšení teploty o přibližně 10 °C u drůbeže od vylíhnutí do 6 týdnů věku mělo za následek snížení spotřeby krmiva o téměř 10 % [14]. To se následně odrazilo ve snížení účinnosti konverze krmiva a denního přírůstku [15]. Uvedené vztahy jsou znázorněny na obrázku 3.

Výroba
Obecně u všech druhů hospodářských zvířat vede snížený příjem krmiva v důsledku tepelného stresu ke snížení produkce mléka, masa a vajec, což následně vede k finančním ztrátám. Dojnice pod tepelným stresem snižují příjem sušiny, což vysvětluje přibližně 35 % snížení produkce mléka [16]. Navíc produktivnější plemena vykazují větší citlivost na tepelný stres než plemena s nižší produkcí, protože díky své větší velikosti vydávají více metabolického tepla. Následně se zvýšením metabolické produkce tepla způsobené tepelným stresem dochází k poklesu produkce mléka. Střední tepelný stres během laktace způsobuje u dojnic snížení příjmu krmiva, metabolické změny a zhoršenou tvorbu mléčných žláz, což má za následek o 25–40 % nižší produkci mléka [17].
Na užitkovost a složení mléka má kromě tepla vliv také vlhkost prostředí, tedy jejich interakce vyjádřená pomocí indexu tepelné vlhkosti (THI). Bylo zjištěno, že dojnice v laktaci začínají trpět tepelným stresem při hodnotách tohoto indexu nad 72 a že s jeho nárůstem klesá obsah mléčných bílkovin a mléčného tuku. Obsah laktózy a bílkovin může být v důsledku tepelného stresu asi o 49 % nižší [18]. Podobné změny ve složení mléka byly zjištěny také u dojných plemen koz a buvolů, avšak v malém počtu studií. U koz pod vlivem zvýšené teploty byl tedy pozorován pokles růstu o 12 %, produkce mléka o 3–10 % a produkce masa o 4 % [11, 19, 20].
Pravděpodobně v důsledku změněné syntézy placentárních hormonů a sníženého příjmu sušiny [22] tepelný stres během posledních 50 dnů březosti u dojnic narušuje vývoj mléčné žlázy a snižuje mlezivo a dojivost [21].
Studie prokázaly, že tepelný stres nepříznivě ovlivňuje produkci masa [23]. U přežvýkavců vlivem tepelného stresu dochází k poklesu růstu, hmotnosti jatečně upraveného těla a tloušťky tukové tkáně, následně ke snížení kvality masa [24]. Existují náznaky, že tepelný stres z nižšího příjmu potravy a snížené dostupnosti glykogenu ve svalech se může odrazit ve vzhledu tmavého masa [25]. Studie však ukázaly, že malí přežvýkavci (kozy a ovce) ve srovnání s velkými vykazují větší adaptaci na teplé a vlhké prostředí [26]. Skot chovaný ve výkrmnách je výrazně zranitelnější kategorií, protože zajetí omezuje jeho schopnost dostatečného chlazení (stín, voda, vítr) a také kvůli vystavení drsným radiačním povrchům a krmení vysokoenergetickými živinami [3].
U prasat, podobně jako u přežvýkavců, dochází při vysokých teplotách ke snížení růstu, hmotnosti jatečně upraveného těla, obsahu vnitrosvalového tuku a kvality masa. Bylo zjištěno, že denní přírůstek u prasat se vlivem vysokých teplot může snížit o 10 % [27]. Fyziologická reakce a důsledky tepelného stresu u prasat jsou schematicky znázorněny na obrázku 4. Tradičně se věřilo, že tyto změny jsou způsobeny sníženým příjmem krmiva, ale nedávné studie ukázaly, že tepelný stres sám o sobě také snižuje rychlost metabolismu a mění postabsorpční metabolismus, bez ohledu na snížený příjem potravy [28].

Drůbež, která je vystavena tepelnému stresu, spotřebuje více energie k udržení tepelné homeostázy na úkor růstu. U brojlerů v tepelné zátěži byl zjištěn pokles růstu, konverze krmiva, hmoty prsní svaloviny a obsahu bílkovin v mase [14, 15]. Vlastnosti, které prokázaly nejvyšší úroveň zranitelnosti vůči tepelnému stresu u nosnic, byly síla skořápky, denní příjem krmiva, hmotnost vajec a produkce vajec [15, 29].
Reprodukce
Obě pohlaví jsou ovlivněna tepelným stresem na reprodukci. Tepelný stres zkracuje cyklus říje a snižuje plodnost samic a zároveň zvyšuje výskyt anestrů a prenatální úmrtnost. Samci, kteří zažívají tepelný stres, mají horší kvalitu spermií, menší varlata a celkově méně plodné sperma. Obě pohlaví vykazovala významné sezónní změny v reprodukční účinnosti [30, 31].
Přestože reprodukce drůbeže je také ovlivněna tepelným stresem, zdá se, že existují určité rozdíly ve srovnání s užitkovostí zjištěnou u savců. Samci brojlerů jsou citlivější na neplodnost způsobenou teplem než samice [30]. U nosnic může environmentální stres zpozdit proces ovulace, snížit kvalitu žloutku a ovlivnit produkci vajec [31].
Snížená reprodukční výkonnost dojných a výkrmných plemen během léta může být pro producenta zvláště nákladná. Gestační a laktující dojnice jsou zvláště náchylné ke zvýšenému metabolickému teplu v důsledku jejich vysoce energetické stravě, vysokého příjmu krmiva a metabolické aktivity potřebné pro trávení a produkci mléka (obrázek 5). Tyto faktory mohou snížit počet zabřeznutí o 10–20 %, ale také způsobit ztráty během těhotenství [32]. Korelace mezi THI a mírou těhotenských ztrát je znázorněna na obrázku 6 [33].


Krátkodobé a dlouhodobé vystavení tepelnému stresu významně zhoršuje plodnost ovcí a snižuje produkci spermatu a jeho kvalitu u beranů, což má za následek méně jehňat na ovci (obrázek 7). Také pokles tělesné hmotnosti jehňat při narození a slabší vývoj mléčných žláz ovcí v důsledku tepelného stresu během březosti může snížit přežití a hmotnost jehňat při odstavu [34].

Zdraví
Změna klimatu, zejména globální oteplování, ovlivňuje zdraví zvířat přímo i nepřímo [3]. V této kapitole se budeme zabývat nemocemi způsobenými působením obou vlivů, protože se jistě týkají zdraví zvířat. Přímé dopady zahrnují choroby přenášené vektory, stejně jako ty způsobené vodou (např. záplavy), půdou, teplotou a vlhkostí nebo přenášené hlodavci. Změna klimatu může vést k přeměně využívání půdy a narušení biologické rozmanitosti, což má za následek různé adaptivní změny u zvířat. Za nepřímé dopady klimatických změn na zdraví zvířat jsou navíc považovány ty, které vedou k modifikaci mikrobiálních společenstev, změnám imunitní a celkové reakce hostitele na patogeny, hladovění a otravě jídlem.
Intenzita dopadu změny klimatu na zdraví hospodářských zvířat závisí na několika faktorech, jako je genotyp, specifická a nespecifická odolnost zvířat vůči chorobám, oblasti chovu a také na charakteristice patogenů [3]. Imunitní systém hraje zásadní roli při zajišťování adekvátního zdraví, ale tepelný stres může významně narušit jeho obrannou funkci [35]. Vysoké teploty a změny srážkového režimu podporují rozvoj a šíření patogenů a následně mohou změnit jejich distribuci a vést ke vzniku nových chorob [36]. V důsledku imunosupresivního účinku tepelného stresu se hospodářská zvířata stávají náchylnějšími k nemocem, což vede ke zvýšení nemocnosti a úmrtnosti ve stádech [3].
Tepelný stres může ovlivnit zdraví hospodářských zvířat i jinak. Pod vlivem několikahodinového tepelného stresu se u prasat mohou rozvinout příznaky gastrointestinálních poruch [37]. Vystavení vysokým okolním teplotám u brojlerů a nosnic vede k nepříznivým změnám ve střevním mikrobiomu [38].
Je důležité poznamenat, že zejména v rozvojových zemích je obtížnější posoudit dopad změny klimatu na výskyt chorob hospodářských zvířat ve srovnání s jinými dopady [3].
Úmrtnost
Zvýšená úmrtnost hospodářských zvířat v důsledku tepelného stresu může mít významný negativní ekonomický efekt. Nadměrná tepelná zátěž zvyšuje úmrtnost podle studií u prasat a dojnic [39]. Bylo také zjištěno, že teplé a vlhké počasí představuje větší hrozbu pro životy krav a prasat než suché a teplé počasí a teploty nad 37,7 °C s vlhkostí nad 50 % jsou nebezpečné [40].
Drůbež má oproti savcům vyšší a kolísavější tělesnou teplotu a je také náchylnější k tepelnému stresu. Za vhodnou teplotu pro chov kuřat lze považovat teplotu do 27 °C nebo tělesnou teplotu do 41 °C. Smrtelné následky pro kuřata však nastávají, když se tělesná teplota zvýší o 4 °C [41].
Reference
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). Livestock and Landscapes: Sustainability Pathways. Food and Agriculture Organizations of the United Nations. Available online: https:/ /www.fao.org/3/ar59le/ ar59le.pdf (accessed on 16 Аugust 2022).
Rojas-Downing, M. M., Nejadhashemi, A. P., Harrigan, T., & Woznicki, S. A. (2017). Climate change and livestock: Impacts, adaptation, and mitigation. Clim. Risk Manag. 16, 145-163.
Cheng, M., McCarl, B., & Fei, C. (2022). Climate Change and Livestock Production: A Literature Review. Atmosphere 13, 140. https://doi.org/10.3390/atmos13010140
Kummu, M., Heino, M., Taka, M., Varis, O., & Viviroli, D. (2021). Climate change risks pushing one-third of global food production outside the safe climatic space, One Earth 4, 5, 720-729. https://doi.org/10.1016/j.oneear.2021.04.017.
Collier, R. J., Baumgard, L. H., Zimbelman, R. B., & Xiao, Y. (2019). Heat stress: Physiology of acclimation and adaptation. Anini. Front. 9, 12-19.
Maibam, U., Hooda, O. K., Sharma, P. S., Upadhyay, R. C., & Mohanty, A. K. (2018). Differential level of oxidative stress markers in skin tissue of zebu and crossbreed cattle during thermal stress. Livest. Sci. 207, 45-50.
Sammad, A., Wang, Y. J., Umer, S., Lirong, H., Khan, I., Khan, A., Ahmad, B., & Wang, Y. (2020). Nutritional Physiology and Biochemistry of Dairy Cattle under the Influence of Heat Stress: Consequences and Opportunities. Animals 10, 793.
Collier, R. J., Gebremedhin, K., Macko, A. R & Roy, K. S. (2012). Genes involved in the thermal tolerance of livestock. In: Environmental stress and amelioration in livestock production. Sejian, V., Naqvi, S. M. K., Ezeji, T., Lakritz, J. and Lal, R. (Eds), Springer-Verlag GMbH Publisher, Germany, 379-410.
Yadav, B., Singh, G., Verma, A. K., Dutta, N., & Sejian, V. (2013). Impact of heat stress on rumen functions. Vet. World 6, 992-996.
Kadzere, C. T., Murphy, M. R., Silanikove, N., & Maltz, E. (2022). Heat stress in lactating dairy cows: A review. Livest. Prod. Sci. 77, 59-91.
Salama, A. A. K., Caja, G., Hamzaoui, S., Badaoui, B., Castro-Costa, A., Façanha, D. A. E., Guilhermino, M. M., & Bozzi, R. (2014). Different levels of response to heat stress in dairy goats. Small Rumin. Res. 121, 73–79.
Lopez, J., Jesse, G. W., Becker, B. A., & Ellersieck, M. R. (1991). Effects of temperature on the performance of finishing swine: I. Effects of a hot, diurnal temperature on average daily gain, feed intake, and feed efficiency. J. Anim. Sci. 69, 1843-1849.
Cervantes, M., Antoine, D., Valle, J. A., Vasquez, N., Camacho, R. L., Bernal, H., & Morales, A. (2018). Effect of feed intake level on the body temperature of pigs exposed to heat stress conditions. J. Therm. Biol. 76, 1-7.
Shakeri, M., Cottrell, J. J., Wilkinson, S., Ringuet, M., Furness, J. B., & Dunshea, F. R. (2018). Betaine and Antioxidants Improve Growth Performance, Breast Muscle Development and Ameliorate Thermoregulatory Responses to Cyclic Heat Exposure in Broiler Chickens. Animals 8, 162.
Shehata, A. M., Saadeldin, I. M., Tukur, H. A., & Habashy, W. S. (2020). Modulation of Heat-Shock Proteins Mediates Chicken Cell Survival against Thermal Stress. Animals 10, 2407.
Rhoads, M., Rhoads, R., VanBaale, M. J., Collier, R., Sanders, S. R., Weber, W. J., Crooker, B. A., & Baumgard, L. H. (2009). Effects of heat stress and plane of nutrition on lactating Holstein cows: I. Production, metabolism, and aspects of circulating somatotropin. J. Dain; Sci. 92, 1986-1997.
Tao, S., Dahl, G., Laporta, J., & Bernard, J. (2018). Effects of heat stress during late gestation on the dam and its calf. J Anim Sci. 96. https://doi.org/10.1093/jas/skz061.
Garner, J. B., Douglas, M., Williams, S. R. O., Wales, W. J., Marett, L. C., Di Giacomo, K., Leury, B. J., & Hayes, B. J. (2017). Responses of dairy cows to short-term heat stress in controlled-climate chambers. Anim. Prod. Sci. 57, 1233–1241.
Pragna, P., Sejian, V., Bagath, M., Krishnan, G., Archana, P. R., Soren, N. M., Beena, V., & Bhatta, R. (2018). Comparative assessment of growth performance of three different indigenous goat breeds exposed to summer heat stress. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 102, 825–836.
Hashem, M. A., Hossain, M. M., Rana, M. S., Islam, M. S., & Saha, N. G. (2013). Effect of heat stress on blood parameter, carcass and meat quality of Black Bengal goat. Bangladesh J. Anim. Sci. 42, 57–61.
Dado-Senn, B., Skibiel, A. L., Fabris, T. F., Dahl, G. E., & Laporta, J. (2019). Dry period heat stress induces microstructural changes in the lactating mammary gland. PloSOne 14
Dahl, G. E., Tao, S., & Laporta, J. (2017). Triennial Lactation Symposium/Bolfa: Late gestation heat stress of dairy cattle programs dam and daughter milk production. J Anim Sci. 95
Gonzalez-Rivas, P. A., Chauhan, S. S., Ha, M., Fegan, N., Dunshea, F. R., & Warner, R. D. (2020). Effects of heat stress on animal physiology, metabolism, and meat quality: A review. Meat Sci. 162, 108025
Summer, A., Lora, I., Formaggioni, P., & Gottardo, F. (2019). Impact of heat stress on milk and meat production. Anim. Front. 9, 39-46
Lees, A. M., Sejian, V., Wallage, A. L., Steel, C. C., Mader, T. L., Lees, J. C., & Gaughan, J. B. (2019). The Impact of Heat Load on Cattle. Animals 9, 322.
Berihulay, H., Abied, A., He, X., Jiang, L., & Ma, Y. (2019). Adaptation Mechanisms of Small Ruminants to Envirornnental Heat Stress. Animals 9, 75.
da Fonseca de Oliveira, A. C., Vanelli, K., Sotomaior, C. S., Weber, S. H., & Costa, L. B. (2019). Impacts on performance of growing-finishing pigs under heat stress conditions: A meta-analysis. Vet. Res. Commun. 43, 37-43.
Ma, X., Wang, L., Shi, Z., Shi, Z., Chen W., Yang, X., Hu, Y., Zheng, C., & Jiang, Z. (2019). Mechanism of continuous high temperature affecting growth performance, meat quality, and muscle biochemical properties of finishing pigs. Genes. Nutr. 14, 23.
Oguntunji, A. O., & Alabi, O. M. (2010). Influence of high environmental temperature on egg production and shell quality: A review. World's Poult. Sci. J. 66, 739-750.
Nawab, A., Ibtisham, F., Li, G., Kieser, B., Wu, J., Liu, W., Zhao, Y., Nawab, Y., Li, K., Xiao, M., An, L. (2018). Heat stress in poultry production: Mitigation strategies to overcome the future challenges facing the global poultry industry. J. Therm. Biol. 78, 131-139.
Ayo, J. O., Obidi, J. A., & Rekwot, P. I. (2011). Effects of Heat Stress on the Well-Being, Fertility, and Hatchability of Chickens in the Northern Guinea Savannah Zone of Nigeria: A Review. ISRN Vet. Sci. 14, 838606.
Hansen, P. J. (1997). Effects of environment on bovine reproduction. (p403-415) In: Current Therapy in Large Animal Theriogenology. R. S. Youngquist (Ed). W. B. Saunders, Philadelphia.
García-Ispierto, I., López-Gatius, F., Santolaria, P., Yániz, J.L., Nogareda, C., López-Béjar, M., & De Rensis, F. (2006). Relationship between heat stress during the peri-implantation period and early fetal loss in dairy cattle. Theriogenology 65, 799-807.
van Wettere, W. H. E. J., Kind, K. L., Gatford, K. L., Swinbourne, A. M., Leu, S. T., Hayman, P. T., Kelly, J. M., Weaver, A. C., Kleemann, D.O., & Walker, S. K. (2021). Review of the impact of heat stress on reproductive performance of sheep. J Animal Sci Biotechnol 12, 26.
Bagath, M., Krishnan, G., Devara, C., Rashamol, V. P., Pragna, P., Lees, A. M., & Sejian, V. (2019). The impact of heat stress on the immune system in dairy cattle: A review. Res. Vet. Sci. 126, 94-102
Paull, S. H., Raffel, T. R., La Fonte, B. E., & Johnson, P. T. J. (2015). How temperature shifts affect parasite production: Testing the roles of thermal stress and acclimation. Funct. Ecol. 29, 941-950.
Pearce, S. C., Sanz-Fernandez, M. V., Hollis, J. H., Baumgard, L. H., & Gabler, N. K. (2014). Short-term exposure to heat stress attenuates appetite and intestinal integrity in growing pigs. J. Anim. Sci. 92, 5444-5454.
Zhu, L., Liao, R., Wu, N., Zhu, G., & Yang, C. (2019). Heat stress mediates changes in fecal microbiome and functional pathways of laying hens. Appl. Microbial. Biotechnol. 103, 461-472.
Vitali, A., Felici, A., Esposito, S., Bernabucci, U., Bertocchi, L., Maresca, C., Nardone, A., Lacetera, N. (2015). The effect of heat waves on dairy cow mortality. J. Dairy Sci. 98, 4572-4579.
Jeffrey, F., & Keown, R. J. G. (2022). How to Reduce Heat Stress in Dairy Cattle. University of Missouri Extension. Available online: https://extension.missouri.edu/publications/g3620 (accessed on 12 September 2022).
Saeed, M., Abbas, G., Alagawany, M., Kamboh, A. A., Abd El-Hack, M. E., Khafaga, A. F., & Chao, S. (2019). Heat stress management in poultry farms: A comprehensive overview. J. Therm. Biol. 84, 414-425.